A.
Pengertian
Kromatografi
Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani
RusiaMichael Tsweet pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam
tanaman dengan cara perkolasi esktrak petroleum eter dalam kolom gelas
yangberisi kalsium karbonat (CaCo3). Saat ini kromatografi merupakan teknik
pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia
analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis
kualitatif, kuantitatif, atau preparative dalam bidang farmasi, lingkungan,
industri, dan sebagainya. Kromatografi suatu teknik pemisahan yang menggunakan
fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase)(Rohman, 2007).
Kromatografi adalah salah satu metode
pemisahan kimia yang didasarkan pada adanya perbedaan partisi zat pada fasa
diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase).Kromatografi berasal dari
bahasa Yunani yaitu χρῶμα yang berarti warna dan γράφειν yang berarti menulis.
Kromatografi dapat bersifat preparatif maupun
analitik.Tujuan kromatografi preparatif biasanya adalah untuk memisahkan
senyawa dalam campuran (biasanya digunakan untuk pemurnian).Kromatografi
analitik digunakan untuk mengetahui perbandingan senyawa dalam campuran.
Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah,
antara lain:
1. Analit
adalah zat yang dipisahkan.
2. Kromatogram
adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya puncak
karakterisitik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.
3. Eluen
adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.
4. Fasa
gerak adalah fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.
5. Fasa
diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya.
6. Waktu
retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.
7. Volume
retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen analit.
B. Pembagian/penggolongan kromatografi
Penggolongan kromatografi
ada 3 yaitu :
1. Berdasarkan
prinsip/mekanisme pemisahan
2. Berdasarkan
fase yang digunakan
3. Berdasarkan
alat yang digunakan
1. Kromatografi
Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahannya pemisahannya, kromatografi dapat
dibedakan menjadi: (a) kromatografi adsorpsi; (b) kromatografi partisi; (c)
kromatografi penukar ion; (d) kromatografi eksklusi ukuran; (e) kromatografi
afinitas.
a. Kromatografi Adsorpsi
Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja dan jangan
sekali-kali dikacaukan dengan proses absorpsi yang berarti penyerapan
keseluruhan. Adsorpsi pada permukaan melibatkan interaksi-interaksi
elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan dipol-dipol, dan penarikan
yang diinduksi oleh dipole.Silika gel merupakan jenis absorben (fase diam) yang
penggunaannya paling luas.Permukaan silika gel terdiri atas gugus Si-O-Si dan
gugus silanol (Si-OH). Kromatografi Adsorpsi seperti:
1) Kromatografi Kertas
Pada kromatografi kertas sebagai penjerap digunakan sehelai kertas
dengan susunan serabut dan tebal yang sesuai.Sebagai alternatif dapat juga
digunakan sistem dua fase.Kertas diimpregnasi dengan salah satu fase yang
kemudianmenjadi fase diam (umumnya fase yang lebih polar dalam hal kertas yang
dimodifikasi).Kromatogram dilakukan dengan merambatkan fase gerak, melalui
kertas. Dapat dilakukan kromatografi menaik, pelarut merambat naik pada kertas
ditarik oleh gaya kapiler ataupun kromatografi menurun, pelarutnya mengalir
oleh gaya gravitasi.
2) Kromatografi Lapis Tipis
Pada KLT, zat penjerap merupakan lapis tipis serbuk halus yang
dilapiskan pada lempeng kaca. Plastik atau logam secara merata, umumnya
digunakan lempeng kaca. Pemisahan yang tercapai dapat didasarkan pada adsorpsi,
partisi atau kombinasi dari kedua efek, tergantung jenis penyangga, cara
pembuatan, dan jenis pelarut yang digunakan. Perkiraan identifikasi diperoleh
dengan pengamatan bercak dengan harga Rf yang identik dan ukuran yang hamper
sama. Dengan menotolkan zat uji dan baku pembanding pada lempeng yang sama.
Bercak dapat dikerok dari lempeng, kemudian diekstraksi dengan pelarut yang
sesuai dan diukur secara spektrofotometri.
Kromatografi kertas termasuk kromatografi partisi.Fasa diamnya air dan
fasa penyokongnya adalah selulosa.Fasa geraknya biasanya merupakan campuran
dari salah satu pelarut-pelarut organik atau air.Setelah elusi selesai, noda
ditandai dengan penanda.Bila noda tidak berwarna maka harus dideteksi secara
fisika dan kimia.
a. Secara fisika dengan menggunakan
uap iodium, lampu UV
b. Secara kimia dengan menggunakan
pereaksi cerium sulfat,
dragendrof,
liberman burchard.
Kecepatan
elusi pada kromatografi kertas dipengaruhi oleh:
a. Ketebalan
kertas
b. Kekentalan
eluen
c. Pelarut,
jangan menggunakan pelarut yang terlalu cepat menguap.
Pada kromatografi kertas, eluen bergerak berdasarkan
gaya kapiler dari bawah keatas (ascending) sama dengan KLT. Tetapi bisa juga
dengan gaya gravitasi bila elusinya dari atas ke bawah (descending). Eluen yang
digunakan pada kromatografi kertas umumnya adalah campuran berbagai pelarut
terutama air.
Kertas
kromatografi yang sering digunakan adalah kertas whatmann yang beredar
bermacam-macam seperti ukuran 20 x 20 cm, 5 x 100 cm dan 50 x 50 cm.
Kromatografi kertasserat fasa penyokongnya lebih pendek, bercaknya lebih
kecil dari pada KLT (kromatografi lapis tipis), waktunya lebih lama dari pada
adsorben lain, tapi lebih singkat dari pada KLTtidak bisa menggunakan pereaksi
H2SO4 karena selulosa akan terdekomposisi.
b. Kromatografi
Partisi
Partisi merupakan analog dengan ekstraksi pelarut.Fase diam diikatkan
pada padatan lapis tipis yang lembam (inert). Karena fase diam cair diikatkan
pada padatan pendukung maka masih diperdebatkan apakah proses adsorpsinya
merupakan partisi murni atau partisi yang dimodifikasi karena absorpsi juga
mungkin terjadi (Rohman,2007).
Cara ini didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut yang tak
bercampur, salah satunya diam (fase diam) dan yang lainnya bergerak (fase
gerak). Pada tahap awal KC, fase diam dibuat dengan cara yang sama seperti
membuat penyangga kromatografi gas (Johnson, Stevenson,1991).
c. Pertukaran
Ion
Cara ini didasarkan pada pertukaran (penjerapan) ion antara fase gerak
dan titik ion pada kemasan.Banyak dammar diperoleh dari kopolimer stirena
divinilbenzena yang telah ditambahi gugus fungsi.Dammar jenis asam sulfonat dan
jenis amin kuartener merupakan pilihan terbaik untuk sebagian besar
pemakaian.Baik fase terikat maupun dammar telah digunakan. Cara tersebut banyak
dipakai dalam ilmu hayat, contohnya pemisahan asam amino, dan dapat pula
dipakai untuk pemisahan kation dan anion (Jonhson, Stevenson,1991)
d. Kromatografi
Eksklusi
Eksklusi berbeda dari mekanisme sorpsi yang lain, yakni dalam eksklusi
tidak ada interaksi spesifik antara solute dengan fase diam. Teknik ini unik
karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat pengepak
(fase diam). Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat
kecil (porous) yang inert.Sebagai fase gerak digunakan cairan. Kromatografi
jenis ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur dan ukuran molekul
(Rohman,2007).
e. Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut
dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir
tahun 1960an dan awal tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam
suatu sampel tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan
protein-protein dalam cairanfisiologis;menentukan kadarsenyawa-senyawa aktif
obat, produk hasil samping proses sintesis,
2. Kromatografi
berdasarkan fase yang digunakan dapat dibedakan menjadi (a) kromatografi Padat
cair; (b) kromatografi Padat cair; (c) kromatografi Cair cair
(k.partisi); (d) kromatografi Gas cair
a.
kromatografi Padat
cair
bila fase
geraknya berupa air sedangkan fase diamnya berupa padatan yang amorf yang dapat
menyerap.
b. Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya
berupa gas dan fase diamnya berupa padatan yang dapat
menyerap/mengadsorp.
c. Kromatografi
cair-cair, bila fase gerak dan diamnya berupa cairan, dimana fase diamnya
dilapisi pada permukaan padatan pendukung yang inert
d. Kromatografi
gas-cair, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa cairan yang
dilapiskanpada padatan pendukung yang inert.
3. Kromatografi Berdasarkan alat yang
digunakan dapat dibedakan menjadi
(a) Kromatografi
planar; (b) HPLC; (c) Kromatografi kertas; (d) Kromatografi cair kinerja tinggi; (e) kromatogarfi vakum; (f) kromatografi kolom.
a. Kromatografi
kolom, apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase
gerak melalui sebuah kolom kemudian setiap komponen terpisahkan berupa
zona-zona pita. Pada kromatografi analitik setiap komponen yang keluar dari
kolom akan dicatat oleh rekorder dan disajikan dalam bentuk puncak (peak) yang
menunjukkan konsentrasi eluen sebagai fungsi waktu. Untuk suatu senyawa yang
mengandung komponen tunggal akan ditandai dengan waktu elusi yang tampak pada
konsentrasi eluen maksimum. Tinggi atau luasan puncak sebanding dengan
konsentrasi komponen sampel. Pada kromatografi preparatif, akan diperoleh sejumlah
fraksi isolate dari komponen sampel dalam fase gerak.
b. Kromatografi planar
(kromatografi lapis tipis dan kromatogafi kertas), apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak
dalam sebuah bidang datar. Senyawa yang bergerak berupa bentuk noda (spot) yang
dapat dikenali dengan bantuan metode fisika, kimia, maupun biologis. Posisi
noda menunjukkan identitas suatu komponen / senyawa, sedangkan besar atau
intensitasnya menunjukkan konsentrasinya. Pada kromatografi planar beberapa
komponen dapat dipisahkan secara bersamaan maupun dipisahkan dengan dua langkah
yang pertama, Cara ini dikenal dengan metode kromatografi dua dimensi.
c. Kromatografi cair
kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan awal tahun 1970an.
Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti
asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam
cairanfisiologis;menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil
samping proses sintesis.
d. Kromatografi cair
vakum (KCV)
Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi
yaitu dengan memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya
yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa
diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum.Fasa diam yang
digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida (Ghisalberti, 2008).
Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV.
Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu:
a. Cara
Basah
Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa
diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke
dalam kolom dan dibuat merata.Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk
lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et
al., 2006).
b. Cara
kering
Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan
fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut
selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan (Sarker et al.,
2006).
Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai
metode seperti preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara
kering (Canell, 1998). Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan
sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan
dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas
dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering
dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan
digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom
yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang
sama (Canell, 1998; Sarker et al., 2006).
e. HPLC
(High Performance Liquid Chromatography)
Teknik pemisahan HPLC memiliki banyak keunggulan dibanding dengan
kromatografi lainnya, diantaranya adalah: cepat dalam proses analisa, resolusi
yang lebih tinggi, sensitivitas detektor yang lebih tinggi, kolom yang dipakai
dapat digunakan kembali, ideal dan cocok untuk zat bermolekul besar dan
berionik dan mudah untuk rekoveri sampel. HPLC boleh dibilang sebagai teknik
tercanggih dalam metode kromatografi. HPLC juga menggunakan sistem instrumen seperti
pada kromatogarfi gas. Di dalam teknik ini juga digunakan tekanan dan kecepatan
yang cukup tinggi sehingga mampu dihasilkan resolusi yang lebih baik.
Jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisa kualitatif dan
kuantitatif
yang
digunakan dalam penetapan kadar dan pengujian Farmakope Indonesia adalah
kromatografi Kolom, Kromatografi Gas, Kromatografi Kertas, Kromatografi Lapis
Tipis dan KCKT.
C. Cara membedakan
fase gerak dan fase diam
1.
Fase
diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen
yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya
interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan
terpisahnya komponen suatu senyawa analit termasuk asam amino. Fase diam dapat
berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau cairan
yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.
2. Fase gerak (Mobile
phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat inert
maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair
dan dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier
gas senyawa mudah menguap (volatil).
Tidak ada komentar:
Posting Komentar