SEPARASI

Pengertian Separasi dan Pemurnian

Separasi adalah pemisahan komponen-komponen dari suatu campuran sehingga menjadi fraksi-fraksi  individual. Fraksi-fraksi itu mungkin berbeda satu sama lain dalam ukuran partikel, fase, atau komposisi kimianya. Prinsip pada proses separasi ini adalah berdasarkan perbedaan densitas ataupun adanya gaya gravitasi.

Pemisahan dan pemurnian adalah proses pemisahan dua zat atau lebih yang saling bercampur serta untuk mendapatkan zat murni dari suatu zat yang telah tercemar atau tercampur. Campuran adalah setia contoh materi yang tidak murni, yaitu bukan sebuah unsur atau sebuah senyawa. Susunan suatu campuran tidak sama dengan sebuah zat, dapat bervariasi, campuran dapat berupa homogen dan heterogen (Ralph H Ptrucci-Seminar, 1996, Kimia Dasar Jilid 1).

Karena perbedaan keadaan agregasi (bentuk penampilan materi) sangat mempengaruhi metode pemisahan dan pemurnian yang diperlukan, maka diadakan pembedaan :

1.         Memisahkan Zat Padat Dari Suspensi.

Suspensi adalah sistem yang didalamnya mengandung partikel sangat kecil (padat), setengah padat, atau cairan tersebutr secara kurang lebih seragam dalam medium cair. Suatu suspensi dapat dipisahkan dengan penyaringan (filtrasi) dan sentrifugasi.

a.         Penyaringan (filtrasi).

Operasi ini adalah pemisahan endapan dari larutan induknya, sasarannya adalah agar endapan dan medium penyaring secara kuantitatif bebas dari larutan. Media yang digunakan untuk penyaring adalah kertas saring,  penyaring asbes murni atau platinum, lempeng berpori yang terbuat dari kaca bertahanan misalnya pyrex dari silika atau porselin.

b.        Sentrifugasi (pemusingan).

Sentrifugasi dapat digunakan untuk memisahkan suspensi yang jumlahnya sedikit. Sentrifugasi digunakan untuk memutar dengan cepat hingga gaya sentrifugal beberapa kali lebih besar daripada gorsa berat, digunakan untuk mengendapkan partikel tersuspensi.

2.      Memisahkan Zat Padat Dari Larutan.

Zat terlarut padat tidak dapat dipisahkan dari larutannya dengan penyaringan dan pemusingan (sentrifugasi). Zat padat terlarut dapat dipisahkan melalui penguapan atau kristalisasi.

a.         Penguapan.

Pada penguapan, larutan dipanaskan sehingga pelarutnya meninggalkan zat terlarut. Pemisahan terjadi karena zat terlarut mempunyai titik didih yang lebih tinggi daripada pelarutnya.

b.        Kristalisasi.

Kristalisasi adalah larutan pekat yang didinginkan sehingga zat terlarut mengkristal. Hal itu terjadi karena kelarutan berkurang ketika suhu diturunkan. Apabila larutan tidak cukup pekat, dapat dipekatkan lebih dahulu dengan jalan penguapan, kemudian dilanjutkan dengan pendinginan melalui kristalisasi diperoleh zat padat yang lebih murni karena komponen larutan yang lainnya yang kadarnya lebih kecil tidak ikut mengkristal.

Rekristalisasi merupakan Teknik pemisahan dengan rekristalisasi (pengkristalan kembali) berdasarkan perbedaan titik beku komponen. Perbedaan itu harus cukup besar, dan sebaiknya komponen yang akan dipisahkan berwujud padat dan yang lainnya cair pada suhu kamar. Contohnya garam dapat dipisahkan dari air karena garam berupa padatan. Air garam bila dipanaskan perlahan dalam bejana terbuka, maka air akan menguap sedikit demi sedikit. Pemanasan dihentikan saat larutan tepat jenuh. Jika dibiarkan akhirnya terbentuk kristal garam secara perlahan. Setelah pengkristalan sempurna garam dapat dipisahkan dengan penyaring. (Syukri S. 1991. Kimia Dasar 1)

3.      Memisahkan Campuran Zat Cair.

Zat cair dapat dipisahkan dari campurannya melalui distilasi. Campuran dua jenis cairan yang tidak saling melarutkan dapat dipisahkan dengan dekantasi dan corong pisah.

a.         Destilasi

Dasar pemisahan dengan destilasi adalah perbedaan titik didih dua cairan atau lebih. Jika canpuran dipanaskan maka komponen yang titik didihnya lebih rendah akan menguap lebih dulu. Dengan mengatur suhu secara cermat kita dapat menguapkan dan kemudian mengembunkan komponen demi komponen secara bertahap. Pengembunan terjadi dengan mengalirkan uap ketabung pendingin. Contohnya memisahkan campuran air dan alkohol. Titik didih air dan alkohol masing-masing 100˚C dan 78˚C. Jika campuran dipanaskan (dalam labu destilasi) dan suhu diatur sekitar 78˚C, maka alkohol akan menguap sedikit demi sedikit. Uap itu mengembun dalam pendingin dan akhirnya didapatkan cairan alkohol murni. (Syukri S. 1999. Kimia Dasar 1)

b.        Dekantasi (pengendapan)

Dekantasi (pengendapan) merupakan proses pemisahan suatu zat dari campurannya dengan zat lain secara pengendapan didasarkan pada massa jenis yang lebih kecil akan berada pada lapisan bagian bawah atau mengendap, contohnya air dan pasir. selain itu zat terlarut (yang akan dipisahkan) diproses diubah menjadi bentuk yang tak larut, lalu dipisahkan dari larutan.

Faktor-faktor yang mempengaruhi kelarutan endapan:

1.      Suhu

2.      Ph

3.      Efek garam

4.      Kompleksasi

5.      Derajat supersaturasi

6.      Sifat pelarut.

Untuk pelarut-pelarut yang lebih ringan dari air, dapat digunakan corong pemisah yang dimodifikasi, yang dirancang untuk menyederhanakan penyingkiran fase yang lebih ringan. Setelah keadaan seimbang, lapisan yang lebih ringan (misalcter) dan lapisan air, didesak keatas dengan memasukkan merkurium melalui kran pada dasar bulatan corong, dengan bantuan sebuah bola pembantu pengatur permulaan merkurium.

 Penggolongan Separasi

Separasi atau pemisahan dapat dibagi menjadi dua yaitu separasi mekanis dan separasi kimia.

a.       Separasi Mekanis.

Separasi mekanis meliputi ukuran, bentuk, berat jenis, sifat listrik, sifat magnet. Contoh metode dari separasi mekanis ini adalah Sedimentasi, sentrifugasi, filtrasi.

b.      Separasi Kimia.

Separasi kimia meliputi kelarutan dan lainnya. Contoh metode untuk separasi kimia ini adalah ekstraksi kimia, destilasi, kristalisasi, ekstraksi gas/desorpsi.

Salah satu teknik separasi adalah separasi secara mekanik. Separasi mekanik  atau pemisahan  mekanik (mechanical separation), digunakan untuk  memisahkan parti­kel antar dua komponen atau lebih yang dilakukan dengan cara mekanis. Separasi mekanik hanya dapat dipakai untuk campuran heterogen, sedangkan untuk larutan homo­gen teknik separasi mekanik ini tidak dapat dilakukan.

Ukuran partikel yang biasa digunakan adalah lebih besar dari 0,1 µm. Teknik-teknik separasi ini didasarkan atas perbedaan fisik antara partikel-partikel itu, seperti ukuran, bentuk, atau densitas. Teknik ini dapat digunakan untuk memisahkan zat padat dari gas, tetesan zat cair dari gas, zat  padat dari zat padat, atau zat padat dari zat cair.

Tahap-tahap Separasi

Tujuan dari tahapan ini adalah untuk menghilangkan (memisahkan) senyawa yang tidak dikehendaki semaksimal mungkin tanpa berpengaruh pada senyawa kandungan yang dikehendaki, sehingga diperoleh ekstrak yang lebih murni.

Proses-proses pada tahapan ini adalah sedimentasi (pengendapan), sentrifugasi (pemusingan), filtrasi (penyaringan) dan pengempaan.

a.       Sedimentasi.

Sedimentasi adalah teknik pemisahan berdasarkan gaya gravitasi dimana partikel-partikel padatan atau cairan yang mempunyai densitas relatif lebih tinggi akan mengendap.

Teknik pemisahan ini adalah teknik yang paling sering digunakan dalam industri pangan karena operasinya sangat sederhana, tidak memerlukan banyak energi dan murah biaya operasionalnya. Sedangkan kekurangan dari metode ini adalah membutuhkan waktu yang lama, kurang kurat serta terkadang slurry masih mengandung partikel terlarut. Contoh-contoh proses pengolahan pangan yang menggunakan prinsip sedimentasi antara lain : proses pembuatan tepung tapioka dan pengolahan limbah industri pangan.

Proses sedimentasi ini terjadi berdasarkan perbedaan densitasnya melalui medium alir, oleh pengaruh gaya gravitasi. Oleh karena itu, biasanya pemisahan tersebut berlangsung lama, terutama bila perbedaan densitas antar komponen tersebut tidak berbeda jauh.

Secara visual, dapat juga dikatakan bahwa sedimentasi merupakan pemisahan suspensi menjadi dua fraksi yaitu fraksi supernatan (fraksi yang jernih) dan fraksi slurry (fraksi yang keruh), suatu pekatan yang berisi fraksi padat pada konsentrasi yang lebih tinggi.

b.      Sentrifugasi.

Sentrifugasi adalah suatu teknik pemisahan yang digunakan untuk menisahkan suspensi yang jumlahnya sedikit. Sentrifugasi adalah pemisahan dengan menggunakan gaya putaran atau gaya sentrifugal.

Partikel dipisahkan dari liquid dengan adanya gaya sentrifugal pada berbagai variasi ukuran dan densitas campuran larutan. Gaya sentrifugal ini bekerja menuju pusat dari rotasi. Gaya sentrifugal digunakan untuk mendapatkan perbedaan tekanan sehingga slurry dalam filter akan mengalir ke penyaring.

Dalam metode sentrifugasi ini partikel dipisahkan dari fluida oleh gaya sentrifugasi yang dikenakan pada partikel. Partikel tersebut dapat berupa solid, gas atau liquid dan fluida. Pemisahan dari gravitasi memakan waktu yang lama karena kedekatan densitas dari partikel dan fluida atau karena kesatuan gaya pada komponen yang bekerja bersamaan seperti emulsi.

Teknik sentrifugasi ini menggunakan alat yang disebut dengan Sentrifugase. Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara horizontal pada jarak radial dari titik dimana titik tersebut dikenakan gaya. Objek yang diputar secara horizontal dan konstan merubah arah dan percepatan walaupun kecepatan rotasi konstan.

Prinsip sentrifugasi ini dapat bekerja secara optimun jika para pengguna dapat memasukkan nilai RPM dan nilai konsentrasi yang tepat ke dalam alat sentrifugasi. Pada operasi sentrifugasi dengan cara pengendapan, kecepatan pengendapan dipengaruhi oleh : kecepatan sudut (ω) disamping faktor-faktor lain seperti pada perhitungan kecepatan sedimentasi. laju alir volumetrik umpan dipengaruhi oleh kecepatan sudut (ω), diameter partikel (Dp), densiti partikel dan cairan, viskositas dan diameter tabung centrifuge.

Metode sentrifugasi memiliki banyak manfaat dalam penelitian terutama dalam praktikum di dalam laboratorium. Diantarannya adalah seagai cara pengisolasi mikroba, cara untuk mengekstrak TSV dan YHV dalam bidang pertanian, cara pemisahan virgin coconut oil (VCO) dari zat pengotornya, pengekstrak senyawa papain dari getah papaya dan lainnya.

Keuntungan lain dari metode sentrifugasi ini adalah lebih efektif bila partikel padatan lebih kecil dan sulit/tidak mungkin disaring. Sedangkan kelemahan dari metode ini adalah harganya mahal dibandingkan dengan metode-metode lain.

c.       Filtrasi.

Filtrasi adalah pemisahan bahan secara mekanis berdasarkan ukuran partikelnya yang berbeda-beda. Filtrasi diterapkan untuk memisahkan bahan padat dari cairan atau gas, misalnya untuk mendapatkan suatu fraksi padat  yang diinginkan atau untuk membuang fraksi padat yang tidak dikehendaki. Filtrasi dapat berupa proses pemisahan dari campuran heterogen yang mengandung cairan dan partikel-partikel padat dengan menggunakan media filter yang hanya meloloskan cairan dan menahan partikel-partikel padat.

Proses pemisahan dengan cara filtrasi dibedakan berdasarkan adanya tekanan dan tanpa tekanan. Proses pemisahan dengan tekanan, umumnya dengan cara divakumkan (disedot dengan pompa vakum). Proses pemisahan dengan teknik ini sangat tepat dilakukan, jika jumlah partikel padatnya lebih besar dibandingkan dengan cairannya.

d.      Pengempaan.

Ekstraksi merupakan salah satu cara pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu bahan yang merupakan sumber komponen tersebut. Sebagai contoh adalah ekstraksi minyak dari kopra atau biji-bijian; ekstraksi nira dari batang tebu; ekstraksi karoten dari buah-buahan; ekstraksi cairan buah dari buah-buahan dan sebagainya.

Komponen yang dipisahkan dengan ekstraksi dapat berupa padatan dari suatu sistem campuran padat-cair, berupa cairan dari suatu sistem campuran cair-cair atau berupa padatan dari suatu sistem padat-padat. Salah satu jenis ekstraksi adalah dengan pengempaan. Biasanya ekstraksi dengan pengempaan dikenal dengan cara mekanis. Ekstraksi cara mekanis hanya dapat dilakukan untuk pemisahan komponen dalam sistem campuran padat-cair. Sebagai contoh adalah ekstraksi minyak dari biji-bijian.

Jumlah ekstrak yang dihasilkan pada operasi ekstraksi pengempaan/penekanan dipengaruhi oleh beberapa faktor diantaranya :

1.           Besarnya tekanan

2.           Lamanya penerapan tekanan maksimum

3.           Besar Kecilnya bahan yang diekstrak

4.           Karakteristik fisik komponen padatannya (keras, liat,  rapuh, dan lunak)

5.           Kekentalan cairan yang diekstrak

Jenis alat kempa yang dikenal, yaitu :

1.        Kempa Hydraulik (Hydraulic Press)

2.        Kempa Ulir (Screw Press).

Kempa Ulir (Screw Press) dalam penggunaannya lebih menguntungkan dibandingkan dengan kempa Hydraulik (Hydraulic Press).

1.      Bekerja secara kontinyu.

2.      Kapasitas Olahnya tinggi.

3.      Efisiensi pengempaan lebih tinggi (kehilangan Minyak kecil).

4.      Pemakaian tenaga (Operator) yang sedikit.

Sedangkan kelemahan Screw Press terutama adalah karena tingginya persentase biji yang pecah & kadang-kadang sulit untuk dimonitor secara visual.

Kromatografi

A.    Pengertian Kromatografi

Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani RusiaMichael Tsweet pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi esktrak petroleum eter dalam kolom gelas yangberisi kalsium karbonat (CaCo3). Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis kualitatif, kuantitatif, atau preparative dalam bidang farmasi, lingkungan, industri, dan sebagainya. Kromatografi suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase)(Rohman, 2007).

Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan kimia yang didasarkan pada adanya perbedaan partisi zat pada fasa diam (stationary phase) dan fasa gerak (mobile phase).Kromatografi berasal dari bahasa Yunani yaitu χρῶμα yang berarti warna dan γράφειν yang berarti menulis.

Kromatografi dapat bersifat preparatif maupun analitik.Tujuan kromatografi preparatif biasanya adalah untuk memisahkan senyawa dalam campuran (biasanya digunakan untuk pemurnian).Kromatografi analitik digunakan untuk mengetahui perbandingan senyawa dalam campuran.

Dalam kromatografi, dikenal beberapa istilah, antara lain:

1.    Analit adalah zat yang dipisahkan.

2.    Kromatogram adalah output visual yang diperoleh dari hasil pemisahan. Adanya puncak karakterisitik yang berbeda menunjukkan adanya senyawa yang berbeda.

3.    Eluen adalah pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit.

4.    Fasa gerak adalah fasa zat yang bergerak pada arah tertentu.

5.    Fasa diam adalah fasa yang tetap pada tempatnya.

6.    Waktu retensi adalah waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem.

7.    Volume retensi adalah volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen analit.

     B.  Pembagian/penggolongan kromatografi

Penggolongan kromatografi ada 3 yaitu :

1.      Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahan

2.      Berdasarkan fase yang digunakan

3.      Berdasarkan alat yang digunakan

1. Kromatografi Berdasarkan prinsip/mekanisme pemisahannya pemisahannya, kromatografi dapat dibedakan menjadi: (a) kromatografi adsorpsi; (b) kromatografi partisi; (c) kromatografi penukar ion; (d) kromatografi eksklusi ukuran; (e) kromatografi afinitas.

      a.       Kromatografi Adsorpsi

Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja dan jangan sekali-kali dikacaukan dengan proses absorpsi yang berarti penyerapan keseluruhan. Adsorpsi pada permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hidrogen, penarikan dipol-dipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipole.Silika gel merupakan jenis absorben (fase diam) yang penggunaannya paling luas.Permukaan silika gel terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Kromatografi Adsorpsi seperti:

1)      Kromatografi Kertas

Pada kromatografi kertas sebagai penjerap digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan tebal yang sesuai.Sebagai alternatif dapat juga digunakan sistem dua fase.Kertas diimpregnasi dengan salah satu fase yang kemudianmenjadi fase diam (umumnya fase yang lebih polar dalam hal kertas yang dimodifikasi).Kromatogram dilakukan dengan merambatkan fase gerak, melalui kertas. Dapat dilakukan kromatografi menaik, pelarut merambat naik pada kertas ditarik oleh gaya kapiler ataupun kromatografi menurun, pelarutnya mengalir oleh gaya gravitasi.

2)      Kromatografi Lapis Tipis

Pada KLT, zat penjerap merupakan lapis tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca. Plastik atau logam secara merata, umumnya digunakan lempeng kaca. Pemisahan yang tercapai dapat didasarkan pada adsorpsi, partisi atau kombinasi dari kedua efek, tergantung jenis penyangga, cara pembuatan, dan jenis pelarut yang digunakan. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan bercak dengan harga Rf yang identik dan ukuran yang hamper sama. Dengan menotolkan zat uji dan baku pembanding pada lempeng yang sama. Bercak dapat dikerok dari lempeng, kemudian diekstraksi dengan pelarut yang sesuai dan diukur secara spektrofotometri.

Kromatografi kertas termasuk kromatografi partisi.Fasa diamnya air dan fasa penyokongnya adalah selulosa.Fasa geraknya biasanya merupakan campuran dari salah satu pelarut-pelarut organik atau air.Setelah elusi selesai, noda ditandai dengan penanda.Bila noda tidak berwarna maka harus dideteksi secara fisika dan kimia.

a.      Secara fisika dengan menggunakan uap iodium, lampu UV

b.      Secara kimia dengan menggunakan pereaksi cerium sulfat,

      dragendrof, liberman burchard.

Kecepatan elusi pada kromatografi kertas dipengaruhi oleh:

a.       Ketebalan kertas

b.      Kekentalan eluen

c.       Pelarut, jangan menggunakan pelarut yang terlalu cepat menguap.

   Pada kromatografi kertas, eluen bergerak berdasarkan gaya kapiler dari bawah keatas (ascending) sama dengan KLT. Tetapi bisa juga dengan gaya gravitasi bila elusinya dari atas ke bawah (descending). Eluen yang digunakan pada kromatografi kertas umumnya adalah campuran berbagai pelarut terutama air.

Kertas kromatografi yang sering digunakan adalah kertas whatmann yang beredar bermacam-macam seperti ukuran 20 x 20 cm, 5 x 100 cm dan 50 x 50 cm.

Kromatografi kertasserat fasa penyokongnya lebih pendek, bercaknya lebih kecil dari pada KLT (kromatografi lapis tipis), waktunya lebih lama dari pada adsorben lain, tapi lebih singkat dari pada KLTtidak bisa menggunakan pereaksi H2SO4 karena selulosa akan terdekomposisi.

      b.       Kromatografi Partisi

Partisi merupakan analog dengan ekstraksi pelarut.Fase diam diikatkan pada padatan lapis tipis yang lembam (inert). Karena fase diam cair diikatkan pada padatan pendukung maka masih diperdebatkan apakah proses adsorpsinya merupakan partisi murni atau partisi yang dimodifikasi karena absorpsi juga mungkin terjadi (Rohman,2007).

Cara ini didasarkan pada partisi linarut antara dua pelarut yang tak bercampur, salah satunya diam (fase diam) dan yang lainnya bergerak (fase gerak). Pada tahap awal KC, fase diam dibuat dengan cara yang sama seperti membuat penyangga kromatografi gas (Johnson, Stevenson,1991).

      c.       Pertukaran Ion

Cara ini didasarkan pada pertukaran (penjerapan) ion antara fase gerak dan titik ion pada kemasan.Banyak dammar diperoleh dari kopolimer stirena divinilbenzena yang telah ditambahi gugus fungsi.Dammar jenis asam sulfonat dan jenis amin kuartener merupakan pilihan terbaik untuk sebagian besar pemakaian.Baik fase terikat maupun dammar telah digunakan. Cara tersebut banyak dipakai dalam ilmu hayat, contohnya pemisahan asam amino, dan dapat pula dipakai untuk pemisahan kation dan anion (Jonhson, Stevenson,1991)

      d.      Kromatografi Eksklusi

Eksklusi berbeda dari mekanisme sorpsi yang lain, yakni dalam eksklusi tidak ada interaksi spesifik antara solute dengan fase diam. Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat pengepak (fase diam). Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert.Sebagai fase gerak digunakan cairan. Kromatografi jenis ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur dan ukuran molekul (Rohman,2007).

      e.       Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan awal tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairanfisiologis;menentukan kadarsenyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis,

       2.      Kromatografi berdasarkan fase yang digunakan dapat dibedakan menjadi (a) kromatografi Padat cair; (b) kromatografi Padat cair;  (c) kromatografi Cair cair (k.partisi); (d) kromatografi Gas cair

a.       kromatografi Padat cair

bila fase geraknya berupa air sedangkan fase diamnya berupa padatan yang amorf yang dapat menyerap. 

           b.  Kromatografi gas-padat, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa padatan yang dapat menyerap/mengadsorp. 

           c. Kromatografi cair-cair, bila fase gerak dan diamnya berupa cairan, dimana fase diamnya dilapisi pada permukaan padatan pendukung yang inert 

           d. Kromatografi gas-cair, bila fase geraknya berupa gas dan fase diamnya berupa cairan yang dilapiskanpada padatan pendukung yang inert.

      3.          Kromatografi Berdasarkan alat yang digunakan dapat dibedakan menjadi

  (a)    Kromatografi planar; (b) HPLC; (c) Kromatografi kertas; (d) Kromatografi cair kinerja tinggi; (e) kromatogarfi vakum; (f) kromatografi kolom.

    a. Kromatografi kolom, apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak melalui sebuah kolom kemudian setiap komponen terpisahkan berupa zona-zona pita. Pada kromatografi analitik setiap komponen yang keluar dari kolom akan dicatat oleh rekorder dan disajikan dalam bentuk puncak (peak) yang menunjukkan konsentrasi eluen sebagai fungsi waktu. Untuk suatu senyawa yang mengandung komponen tunggal akan ditandai dengan waktu elusi yang tampak pada konsentrasi eluen maksimum. Tinggi atau luasan puncak sebanding dengan konsentrasi komponen sampel. Pada kromatografi preparatif, akan diperoleh sejumlah fraksi isolate dari komponen sampel dalam fase gerak.

      b. Kromatografi planar (kromatografi lapis tipis dan kromatogafi kertas), apabila komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak dalam sebuah bidang datar. Senyawa yang bergerak berupa bentuk noda (spot) yang dapat dikenali dengan bantuan metode fisika, kimia, maupun biologis. Posisi noda menunjukkan identitas suatu komponen / senyawa, sedangkan besar atau intensitasnya menunjukkan konsentrasinya. Pada kromatografi planar beberapa komponen dapat dipisahkan secara bersamaan maupun dipisahkan dengan dua langkah yang pertama, Cara ini dikenal dengan metode kromatografi dua dimensi.

      c. Kromatografi cair kinerja tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dikembangkan pada akhir tahun 1960an dan awal tahun 1970an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairanfisiologis;menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis.

      d. Kromatografi cair vakum (KCV)

Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan memisahkan crude extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum.Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau alumunium oksida (Ghisalberti, 2008).

Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu:

            a.        Cara Basah

Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata.Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan (Sarker et al., 2006).

            b.        Cara kering

Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan (Sarker et al., 2006).

Preparasi sampel saat akan dielusi dengan KCV juga memiliki berbagai metode seperti preparasi fasa diam. Metode tersebut yaitu cara basah dan cara kering (Canell, 1998). Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama (Canell, 1998; Sarker et al., 2006).

           e.       HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Teknik pemisahan HPLC memiliki banyak keunggulan dibanding dengan kromatografi lainnya, diantaranya adalah: cepat dalam proses analisa, resolusi yang lebih tinggi, sensitivitas detektor yang lebih tinggi, kolom yang dipakai dapat digunakan kembali, ideal dan cocok untuk zat bermolekul besar dan berionik dan mudah untuk rekoveri sampel. HPLC boleh dibilang sebagai teknik tercanggih dalam metode kromatografi. HPLC juga menggunakan sistem instrumen seperti pada kromatogarfi gas. Di dalam teknik ini juga digunakan tekanan dan kecepatan yang cukup tinggi sehingga mampu dihasilkan resolusi yang lebih baik.

Jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisa kualitatif dan kuantitatif

yang digunakan dalam penetapan kadar dan pengujian Farmakope Indonesia adalah kromatografi Kolom, Kromatografi Gas, Kromatografi Kertas, Kromatografi Lapis Tipis dan KCKT.

     C.  Cara membedakan fase gerak dan fase diam

1.            Fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa analit termasuk asam amino. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung.

     2.   Fase gerak (Mobile phase) merupakan pembawa analit (asam amino), dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatil).